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慢病毒系列,基因調控“多面手”(內含活動)

更新時間:2024-03-28      點擊次數:134

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慢病毒常被用作基因傳遞和基因編輯工具,在基因治療、基因表達調控、疾病模型構建等領域有著廣泛的應用

主要特點

1. 穩定的基因傳遞和表達: 慢病毒載體能夠將外源基因穩定地整合到宿主細胞基因組中,并且在細胞分裂過程中傳遞給后代細胞。這種整合性基因傳遞方式確保了外源基因在宿主細胞中的長期穩定表達。

2. 可控的基因表達水平: 通過調整慢病毒載體的構建和設計,可以實現對外源基因表達水平的調控。例如,可以利用不同的啟動子、增強子和調節元件來控制基因的轉錄水平,從而實現對目標基因的表達量調節。

3. 多功能性應用: 慢病毒載體不僅可以用于基因傳遞和基因表達調控,還可以用于基因編輯、基因治療、細胞工程等多種應用,如CRISPR/Cas9介導的基因編輯、CAR-T細胞治療等。通過慢病毒載體的介導,可以將基因編輯工具或特定基因序列導入目標細胞中,實現對基因的精準編輯和調控,從而改變細胞的功能和特性,實現基因修復、突變或敲除等功能。

讓我們來看看如何利用慢病毒載體多面操縱基因調控

一、慢病毒載體介導編碼基因過表達及點突變

★文章標題:Gain-of-function mutations in the catalytic domain of DOT1L promote lung cancer malignant phenotypes via the MAPK/ERK signaling pathway

★發表期刊:Science Advances

★作者單位:沈陽藥科大學

本文中,作者鑒定了組蛋白甲基轉移酶DOT1L中的一系列功能獲得性突變。其中強的是位于催化DOT結構域R231Q,R231Q可以增強DOT1L的底物結合能力。此外,R231Q 在體外和體內促進肺癌細胞的細胞生長和耐藥性。機制研究還表明,R231Q突變體通過富集RAF1啟動子上的H3K79me2和表觀遺傳調控下游靶標的表達來特異性激活MAPK/ERK信號通路。DOT1L抑制劑(SGC0946)和MAPK/ERK軸抑制劑(binimetinib)的聯合運用可以有效逆轉R231Q誘導的表型。以上研究結果揭示了表觀遺傳酶的功能獲得性突變,并為肺癌患者的精準治療提供了有希望的見解。


圖1. 組蛋白甲基轉移酶DOT1L的R231Q位點突變可以增強DOT1L的底物結合能力,促進腫瘤生長

感染細胞

人大細胞肺癌細胞

調控方式

基因過表達(全長/點突變)

載體信息

LV-DOT1L-WT/LV-DOT1L-R231Q

二、慢病毒載體介導非編碼基因circRNA過表達

★文章標題:CircCRIM1 suppresses osteosarcoma progression via sponging miR146a-5p and targeting NUMB

★發表期刊:American Journal Of Cancer Research

★作者單位:江蘇大學醫學院

CircCRIM1是一種環狀RNA,通過反向剪接基因CRIM1形成。最近的研究表明,CircCRIM1在包括骨肉瘤(OS)在內的多種惡性腫瘤的腫瘤發生中具有多種功能。本文作者研究了circCRIM1在OS進展中的作用和機制。通過檢索GSE96964的circRNA表達微陣列數據集,篩選OS和人成骨細胞(hFOB1.19)中差異表達的circRNA(包括circCRIM1)。RT-qPCR檢測circCRIM1及其海綿miRNA和靶基因的表達水平。通過體外功能獲得實驗研究了circCRIM1對OS細胞增殖、遷移和侵襲的影響。通過測量裸鼠皮下和原位腫瘤生長來評估 circCRIM1對OS的體內功能。circCRIM1的過表達抑制了OS細胞在體外的遷移、侵襲、增殖和體內OS腫瘤的生長。在機制上,作者通過生物信息學預測將miR146a-5p鑒定為circCRIM1的海綿miRNA,并通過報告基因檢測和FISH分析證實了它們的相互作用和共定位。這種相互作用導致下游靶基因NUMB的表達增加,這將導致Notch信號通路的抑制。作者進一步證明了miR146a-5p過表達可以逆轉OS細胞中circCRIM1誘導的抗腫瘤作用。以上研究結果支持circCRIM1通過海綿化miR146a-5p及其下游靶標NUMB在OS中充當腫瘤抑制因子。



圖2. circCRIM1的過表達抑制了骨肉瘤細胞在體外的遷移、侵襲、增殖和體內骨肉瘤瘤的生長

感染細胞

人骨肉瘤細胞

調控方式

非編碼基因過表達(circRNA)

載體信息

LV-circCRIM1

三、慢病毒載體介導非編碼基因LncRNA干擾

★文章標題:Long noncoding RNA AGPG regulates PFKFB3-mediated tumor glycolytic reprogramming

★發表期刊:Nature communications

★作者單位:中山大學

腫瘤細胞通常會重新編程其新陳代謝以實現快速增殖。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在代謝重塑中的作用及其潛在機制仍然難以捉摸。通過篩選,作者發現lncRNA AGPG是食管鱗狀細胞癌(ESCC)中糖酵解活性增加和細胞增殖所必需的。在機制上,AGPG結合并穩定 6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3),通過阻止APC/C介導的泛素化,AGPG 保護PFKFB3免受蛋白酶體降解,導致PFKFB3在癌細胞中積累,隨后激活糖酵解通量并促進細胞周期進程。AGPG也是p53的轉錄靶標;TP53的缺失或突變會觸發AGPG的顯著上調。值得注意的是,抑制AGPG會顯著損害患者來源的異種移植物(PDX)模型中的腫瘤生長。臨床上,AGPG在許多癌癥中高表達,AGPG高表達水平與預后不良相關,提示AGPG是一種潛在的生物標志物和癌癥治療靶點。



圖3. 敲低AGPG抑制腫瘤形成抑制增殖和下游基因表達

感染細胞

人食管鱗癌細胞

調控方式

非編碼基因干擾(LncRNA)

載體信息

LV-shAGPG

和元生物自主研發獲批專li的Vpack慢病毒包裝系統,攻克病毒不出毒和滴度低的問題,保證lncRNA表達更精確,載體熒光表達更亮,病毒出毒更穩定


圖4. 和元生物VPack系統LncRNA表達及感染效果圖

四、CRISPR/Cas9技術介導基因敲除

★文章標題:A novel protein RASON encoded by a lncRNA controls  oncogenic RAS signaling in KRAS mutant cancers

★發表期刊:Cell Research

★作者單位:南京大學

作者報道了RASON是一種由LINC00673編碼的新型蛋白質,是致癌RAS信號轉導的正調節因子。RASON在胰腺導管腺癌(PDAC)患者中異常過表達,在體外促進人PDAC細胞系的增殖和體內腫瘤生長。CRISPR/Cas9介導的小鼠胚胎成纖維細胞中Rason的敲除抑制KRAS介導的腫瘤轉化。Rason的基因缺失消除了LSL-KrasG12D Trp53R172H/+型小鼠中致癌基因KRAS驅動的胰腺癌和肺癌發生。從機制上講,RASON直接與KRASG12D/V結合并抑制內源的和GTP酶激活蛋白(GAP)介導的GTP水解,從而維持KRASG12D/V處于 GTP結合的活躍狀態。在治療上,敲除 RASON會使KRAS突變的胰腺癌細胞和患者來源的類器官對EGFR抑制劑敏感。以上研究結果表明,RASON是致癌基因KRAS信號轉導的關鍵調節因子,也是一個KRAS突變癌癥的有前途的治療靶點。


圖5. CRISPR/Cas9介導的小鼠胚胎成纖維細胞中Rason的敲除抑制KRAS介導的腫瘤轉化

感染細胞

小鼠胚胎成纖維細胞

調控方式

CRISPR/Cas9敲除

載體信息

LV-sgRason-spCas9

五、CRISPRa技術實現內源性轉錄激活

除了可以基因敲除外,CRISPR技術也可以對內源基因的轉錄進行激活。利用CRISPR/Cas9技術進行基因的敲除、插入、替換依賴的是Cas9蛋白切割DNA的能力,而如果人為突變RuvC1、HNH兩個剪切位點,Cas9蛋白的切割能力損失成為dCas9蛋白,但仍可以與gRNA結合形成復合物。dCas9和gRNA復合物可以結合在DNA的特定位置上,在此基礎上,研究人員在復合物的后方連接一些轉錄調控元件,如轉錄激活的VP64、VP16元件等,同時將復合物錨定在基因轉錄起始區域的上游,即可實現對特定基因的轉錄激活。


圖6. SAM技術實現內源性基因激活

Chavez A,et al,.Nat Methods,2016


圖7. 加入gRNA后mCherry表達明顯增強

總的來說,慢病毒載體在基因調控中具有穩定的基因傳遞和表達能力,可實現對外源基因的可控和特異性表達,為基因研究、基因治療和細胞工程等領域提供了強大的工具和平臺。

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