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關于蛋白電泳那些事2

發布時間:2021-08-18      點擊次數:2734
免疫印跡法(WB)、免疫組化(IHC)和酶聯免疫吸附實驗(ELISA),是免疫學常用工具,主要應用于蛋白的定位、定性和定量。
其中 WB實驗是先通過進行跑電泳后,然后將分離好的蛋白質樣品轉移到固相載體上,再利用抗原-抗體-標記物顯色來檢測樣品,常用于定性和半定量。
圖| WB實驗流程圖
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WB實驗常見十問
1、細胞水平做WB,一般多少數量細胞提的蛋白夠做WB?做組織樣品的WB的時候,怎樣處理樣品?
答:一般5×10^6就足夠了;特殊情況需根據自己的研究來確定。
必須進行研磨、勻漿、超聲處理(注意降溫),蛋白質溶解度會更好,離心要充分(12000轉/min,10-15min)。膜蛋白必須用更劇烈的方法抽提,低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點就是組織中的蛋白酶活性更強,需要注意抑制蛋白酶的活性(加入足量的PSMF)。
2、蛋白變性后可以存放多久?
答:-80℃,若沒有反復取出凍融,保存一兩年沒有問題。最關鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解了)。
3、同一蛋白樣品能同時進行兩種因子的WB檢測嗎?
答:當然可以,有的甚至可以同時測幾十種樣品;有時如果抗體特異性高且效價高,同時使用2種一抗,可在一張膜上檢測2種不同蛋白。
4、上樣超載多少會對實驗有影響?可以用什方法來增加上樣量?
答:正常超載30%不會有問題的,但不建議超載加樣。
可以濃縮樣品,或者根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白,還可以考慮加大膠的厚度,以增大上樣孔體積,比如嘗試1.5mm厚的膠。
5、我所測定的蛋白分子量是100KD左右,理說分離膠應當采用7.5%,但資料卻要求分離膠和濃縮膠均采用11%的配方,不知為何?
答:上述提到的兩種凝膠均可以使用,因為105KD的蛋白在上述兩種膠的線性分辨范圍內,但需注意不同濃度目的條帶位置肯定會發生一定地偏移。具體參照如下圖(李記有3款預混膠、預制膠,詳情請參考“關于蛋白電泳那些事")
6、一般一次上樣的蛋白總量是多少,跟目的蛋白的表達量有關系嗎?
答:WB一般上樣30-100μg不等,結果跟目的蛋白的表達豐度、上樣量、一二抗的量以及孵育時間都有關系,也與顯色時間長短有關。
最開始摸條件時,各個步驟都可以量多一點時間長一點(背景也容易就出來了)。要拿到好的結果,如果抗體好的話比較容易,抗體不好的話就需要反復測試。
7、想問一下細胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎?
答:一般來說提取時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了,操作時保持冰浴,保持低溫。除非有文獻特別指明必須使用特殊方法,一般來說沒有區別。
8、轉膜后經麗春紅染色的條帶,為什么大蛋白分子的一端的轉膜表現不是很好?
答:這是正常的,大分子的蛋白轉移很慢,你延長轉移時間和電流,大分子一端就會好的多,但是小分子的就有可能會變淡(轉過的表現)。注意一點:麗春紅染色較好,不是你的目標蛋白成功轉移至膜上的標準,只能作為一個粗略參考。
9、做半定量WB,內參β-actin,GAPDH哪個好?
答:一般選用β-actin就可以,也可以使用GAPDH,但是如果做能量、代謝這方面的研究還是盡量選擇β-actin。
10、請問一下PVDF膜和NC膜的區別是什么?什么PVDF膜用甲醇浸泡的目的?
答:PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合,有疏水作用但相對較弱,和蛋白接合較牢,不易脫落,結果較好。PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團,使它更容易跟帶負電的蛋白質結合,做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。
硝酸纖維素膜(NC膜)是通過疏水作用來和蛋白質相聯,反復洗幾次后,蛋白容易掉下來,結果較差。

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活動時間:2021.8.10-2021.8.13
活動編號:Li210810H
活動范圍:全國生物相關終端客戶

 

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